LumiTracker ER Green 和 LumiTracker ER Red 具有細(xì)胞滲透性，對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng) (ER) 染色劑具有高度選擇性，可用于活細(xì)胞成像。兩種 ER 染色劑都是 BDP 染料與格列本脲（格列本脲）偶聯(lián)的衍生物。格列本脲與 ATP 敏感鉀通道 (K ATP ) 的磺酰脲 (SUR) 受體結(jié)合，該受體在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上很突出。

用甲醛固定后，染色部分保留。 LumiTracker ER Green 和 LumiTracker ER Red 不適合對(duì)固定后的細(xì)胞進(jìn)行染色。

注意：格列本脲的藥理活性可能會(huì)影響 ER 功能。某些特殊細(xì)胞類(lèi)型中磺脲類(lèi)受體的可變表達(dá)可能會(huì)導(dǎo)致非 ER 標(biāo)記。

溶液的制備

1.1 庫(kù)存溶液的制備

• 將 50 μg LumiTracker ER Green 溶解在 64 μL DMSO 中，以獲得 1 mM 儲(chǔ)備溶液。

• 將 50 μg LumiTracker ER Red 溶解在 55 μL DMSO 中，以獲得 1 mM 儲(chǔ)備溶液。

注意：我們建議將儲(chǔ)備溶液儲(chǔ)存在?20°C或?80°C避光條件下。避免反復(fù)凍融循環(huán)。

1.2 工作液的配制

用鈣和鎂 (HBSS/Ca/Mg) 在 Hank's 平衡鹽溶液中稀釋 LumiTracker ER 染色劑的儲(chǔ)備溶液，以獲得工作溶液。使用 100 nM 至 1 μM 的濃度。 LumiTracker ER 染色劑的稀釋度取決于細(xì)胞類(lèi)型和密度，應(yīng)通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定。

細(xì)胞染色

2.1 懸浮細(xì)胞染色

1. 1000 g離心細(xì)胞懸液 3-5 分鐘；棄去上清液。

2. 用預(yù)熱的 HBSS 在 37°C 下清洗細(xì)胞兩次，每次 5 分鐘。

3. 推薦的細(xì)胞密度為1×10 6 個(gè)細(xì)胞/mL。

4. 將 1 mL 預(yù)熱的 LumiTracker ER 工作溶液添加到管中，并在 37 °C 和 5% CO 2下孵育細(xì)胞 15-30 分鐘。

5. 室溫下以 400 g離心細(xì)胞 3-4 分鐘；棄去上清液。

6. 用培養(yǎng)基清洗染色細(xì)胞兩次。

7. 用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基或 PBS 重懸細(xì)胞。

8. 通過(guò)流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞。

9. 對(duì)于熒光顯微鏡，將一滴染色的細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到載玻片上。用蓋玻片蓋住細(xì)胞。

2.2 貼壁細(xì)胞染色

1. 在無(wú)菌蓋玻片上培養(yǎng)細(xì)胞。

2. 貼壁細(xì)胞可以直接在蓋玻片上染色。

3. 從蓋玻片中吸出介質(zhì)。

4. 用 37°C 預(yù)熱的 HBSS 沖洗細(xì)胞。

5. 加入 100 μL 預(yù)熱的 LumiTracker ER 工作溶液，輕輕搖動(dòng)以全覆蓋細(xì)胞。在 37 °C 和 5% CO 2下孵育細(xì)胞 15-30 分鐘。

6. 用培養(yǎng)基清洗染色細(xì)胞兩次。

7. 如果通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，則需要在染色前重懸細(xì)胞。

8. 對(duì)于熒光顯微鏡，將帶有染色細(xì)胞的蓋玻片翻轉(zhuǎn)到載玻片上，將它們放置在載玻片和蓋玻片之間。

細(xì)胞固定

1. 如果要固定染色的細(xì)胞，請(qǐng)?jiān)?4% 甲醛中于 4 °C 下孵育 2 分鐘。

2. 固定細(xì)胞用 PBS 清洗兩次，每次 5 分鐘。

3. 使用封固劑將細(xì)胞封固在蓋玻片下 。